在掃描電子顯微鏡 (SEM) 中，對某些敏感樣品進行冷凍處理可以顯著減少電子束損傷，特別是對一些生物樣品、聚合物或其他低導電性材料。冷凍 SEM 技術（Cryo-SEM）通過將樣品快速冷凍并維持低溫環境來避免電子束引起的樣品變形或損壞。以下是如何在 SEM 中進行樣品冷凍以減少電子束損傷的步驟和方法。

1. Cryo-SEM 的原理

Cryo-SEM（冷凍掃描電鏡）通過快速冷凍樣品并維持在低溫度下成像，避免了電子束在樣品上產生的熱效應和化學變化。這種方法的主要目的是：

防止水分蒸發，特別是對含水的生物樣品或水凝膠類材料。

通過降低溫度來減少電子束引起的損傷、熱效應和樣品帶電效應。

保持樣品的自然狀態而不需要進行復雜的化學固定或鍍膜。

2. 樣品制備步驟

冷凍 SEM 樣品的制備是 Cryo-SEM 成像中關鍵的部分。以下是典型的樣品制備流程：

1) 快速冷凍（快速凍結）

樣品需要通過快速冷凍（通常稱為 vitrification）來保持樣品原始狀態，避免冰晶的形成。

常用的方法包括浸入冷凍或高壓冷凍。浸入冷凍：將樣品快速浸入液氮或液氮溫度的液體（如液態丙烷）。這一過程可使水分以玻璃態（非晶態）凍結，避免晶體冰的形成。

高壓冷凍：使用高壓冷凍裝置對樣品施加高壓，迅速降低溫度以抑制冰晶生成。

2) 轉移到冷凍樣品臺

冷凍后的樣品需要在低溫環境下轉移到 SEM 的冷凍樣品臺上。這通常是通過冷凍轉移桿進行的，確保樣品不與環境接觸，避免升溫。

樣品的溫度通常保持在 -140°C 到 -196°C，具體取決于樣品的特性和成像要求。

3) 樣品鍍膜

雖然低溫可以減少樣品損傷，但仍然有些樣品（如絕緣材料或生物樣品）在電子束下可能產生帶電效應。這時可以使用低溫鍍膜技術（通常為金、鉑或碳），在樣品表面沉積一層導電薄膜來減少帶電效應。

鍍膜過程也須在低溫下進行，以保持樣品的冷凍狀態。

3. SEM 冷凍系統操作

冷凍樣品準備好后，需要將其插入到 SEM 中的冷凍系統?，F代 Cryo-SEM 通常配備了冷凍臺和低溫裝置，可以穩定保持樣品的冷凍狀態。

1) 加載樣品

使用冷凍轉移桿將樣品從冷凍準備臺轉移到 SEM 的冷凍樣品室。

樣品被安裝在冷凍樣品臺上，并通過液氮冷卻系統保持低溫。

2) 調節溫度

通過 SEM 的軟件接口，可以設定并監控樣品臺的溫度。通?？刂圃?-150°C 到 -190°C，具體取決于樣品的特性。

樣品在整個成像過程中需要保持在設定溫度，以避免由于溫度波動而導致樣品變形或損壞。

4. 電子束設置與操作

在 Cryo-SEM 中，電子束的參數設置也應根據樣品的低溫特性進行調整，以進一步減少電子束損傷：

降低加速電壓：低導電性樣品容易受到電子束損傷，因此需要使用較低的加速電壓（例如 1 kV 到 5 kV），減少對樣品的損傷。

降低束流密度：減少電子束的強度和束流密度也能降低熱效應和損傷。

控制掃描速度：通過使用較慢的掃描速度，能夠進一步減小熱累積，并有助于減少對樣品的損壞。

5. 低溫成像技術

在低溫環境下進行成像可以大幅減少樣品的損傷，特別是在生物學和材料科學領域。以下是兩種常見的成像方式：

1) 冷凍斷裂法（Cryo-fracture）

對于細胞或其他多層樣品，冷凍斷裂技術能夠在低溫度下將樣品斷裂，暴露內部結構。隨后可直接在 SEM 中成像，以觀測次表面結構。

樣品斷裂后，仍需保持在冷凍臺上，并進行成像操作。

2) 冷凍蝕刻（Cryo-etching）

在某些情況下，樣品表面被冷凍覆蓋的物質（如水分）會影響成像。冷凍蝕刻可以通過逐步升溫，讓樣品表面升溫到略高于冷凍溫度（如 -90°C 到 -100°C），以輕微升華表面水分，暴露出樣品的表面結構。

該過程使樣品表面更加清晰，有利于高分辨率成像。

6. 成像后處理與升溫

在成像結束后，樣品通常需要經過升溫和解凍處理：

升溫控制：逐步升溫可以避免樣品因快速升溫而破壞結構，特別是在需要進一步處理或分析的情況下。

樣品處理：根據樣品性質，可以在升溫后對其進行其他表面處理、化學分析或保存。

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